微生物限度檢查方法(薄膜過濾法) 驗證方案

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一、驗證方案的起草與批準(zhǔn)

1.驗證方案起草

起草人： 起草時期： 年 月 日

2.驗證小組成員：

3.驗證方案審核

4.驗證方案批準(zhǔn)

批準(zhǔn)人： 批準(zhǔn)日期：

二、驗證方案

1.驗證目的和原理

1.1驗證目的

為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需要變更時，應(yīng)報驗證委員會批準(zhǔn)。

1.2原理

通過比較試驗4組中試驗菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評價整個檢驗方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。

2.驗證方法步驟

2.1驗證前的準(zhǔn)備：進(jìn)行微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格

按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)包括G—、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。

2.2驗證試驗的操作計劃：用3個不同批號產(chǎn)品微生物限度檢測方法進(jìn)行平行試驗，通過計算回收率來判斷限度檢查方法是否對產(chǎn)品有影響。

2.3試驗結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評價方法“ ”的微生物限度檢查對檢品中微生物的抑制性，試驗結(jié)果應(yīng)顯示3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗組回收率也不低于70%。

3.試驗實施

3.1試驗前的準(zhǔn)備

3.1.1主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。

3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部潔凈度為100級（或放置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持對環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。

3.1.3試驗樣品： 

批號： 批號： 批號： 

3.1.4培養(yǎng)基：

3.1.5稀釋液：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

以上經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌30min。

3.1.6驗證用微生物名稱及其編號

實驗菌株的來源： 

編號由菌名首字母—傳代代數(shù)—制備日期組成。

3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）、無菌移液管（5ml）

4.驗證方法

4.1菌液的制備

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在30～35℃下培養(yǎng)18～24小時，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在23～28℃下培養(yǎng)24～48小時。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在23～28℃下培養(yǎng)5～7天。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50～100cfu的菌懸液。

4.2實驗方法

供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻□，用勻漿儀混勻□，置45℃水浴使膠囊殼溶化混勻□，制成1：10均勻的供試液。

A樣品試驗組

取1:10供試液（相當(dāng)1g或1ml供試品）10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，在*后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

B菌液組

取上述制備菌液各1ml加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

C供試品對照組

取上述1：10供試液10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將濾膜取出，接觸樣品的面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

D稀釋劑對照組

取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3次，每次100ml，在*后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

4.3培養(yǎng) 

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在30～35℃下培養(yǎng)48小時，將白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培養(yǎng)72小時，點計菌落數(shù)。

5.試驗結(jié)果

5.1產(chǎn)品試驗組微生物生長檢查情況： 批號： 

5.2供試品對照組微生物生長檢查情況： 批號： 

5.3稀釋劑對照組微生物生長檢查情況： 批號： 

5.4菌液組微生物生長檢查情況： 批號： 

6.回收率計算

6.1稀釋劑對照組菌回收率

表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

6.2試驗組菌回收率

表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)－供試品對照組的平均菌落數(shù)）÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

7.結(jié)論：

7.1經(jīng)過驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為 %、 %、 %、 %、 %。

7.2稀釋劑回收率為 %、 %、 %、 %、 %。 

以上驗證結(jié)果證明，本品 采用上述方法進(jìn)行微生物限度檢查。

檢驗人： 復(fù)核人：

8.驗證結(jié)果評價分析

質(zhì)控部負(fù)責(zé)各項驗證、試驗結(jié)果記錄，驗證小組根據(jù)驗證、試驗結(jié)果進(jìn)行評價，起草驗證報告，報驗證委員會。

驗證委員會負(fù)責(zé)對驗證結(jié)果進(jìn)行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：

（1） 驗證試驗是否有遺漏；

（2） 驗證實施過程中對驗證方案有沒有修改，修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)；

（3） 驗證記錄是否完整；

（4） 驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需進(jìn)一步補(bǔ)充試驗。

9.*終審批

驗證報告由驗證組長審核后，報驗證總負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，并簽發(fā)驗證證書。

驗證報告

年 月 日至 年 月 日，驗證小組根據(jù)批準(zhǔn)的微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證文件對微生物限度檢查法進(jìn)行了相關(guān)的一系列驗證工作，達(dá)到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項說明如下：

1、 驗證方案在實施過程中未做修改。

2、 驗證方案各項性能指標(biāo)在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內(nèi)。

3、 驗證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實。

4、 驗證結(jié)果符合設(shè)計要求和GMP原則要求，可以投入使用。

5、 組分或檢驗條件改變時須重新驗證。

以上情況，請驗證委員會審批！

驗證小組：

年 月 日